§ 28. Сучасні молекулярно-генетичні методи досліджень спадковості людини

Молекулярно-генетичні методи досліджень спадковості людини працюють переважно з молекулами ДНК і білків. Вони використовують біохімічні властивості цих молекул, у першу чергу те, що ДНК і білки є біополімерами. їх широко використовують у різноманітних наукових дослідженнях та в медицині.

Сучасні молекулярно-генетичні методи можна умовно поділити на кілька груп:

• виокремлення й очищення потрібних молекул,

• ампліфікація (копіювання) ДНК,

• обробка даних і моделювання.

Зазвичай усі ці методи використовують у комплексі. До найбільш поширених технологій зараз належать секвенування ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, генетичні маркери та ДНК-мікрочіп.

Секвенування ДНК

Метод секвенування ДНК полягає у встановленні послідовності нуклеотидних основ (аденіну, тиміну, гуаніну й цитозину) на певній ділянці ДНК для подальшої ідентифікації такої ділянки і встановлення складу РНК та білків, які можуть бути на ній закодовані. Кількість нуклеотидних основ у ДНК еукаріотів дуже велика, тому її визначають за допомогою спеціальних приладів — секвенаторів (мал. 28.1), які здійснюють цей процес автоматично. Це дозволило в процесі реалізації проекту «Геном людини» здійснити секвенування ДНК всіх хромосом людини, хоча загальний розмір її геному становить 3,2 мільйярди пар нуклеотидів.

Мал. 28.1. Секвенатор — прилад для здійснення секвенування ДНК

Секвенування ДНК широко використовують для діагностики спадкових захворювань і в судовій медицині для встановлення осіб або ідентифікації біологічного матеріалу.

Полімеразна ланцюгова реакція

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) є методом, завдяки якому можуть більш ефективно працювати всі інші технології роботи з ДНК. Її головне завдання — збільшити кількість молекул ДНК, необхідних для їх аналізу. Якщо молекул досліджуваної ДНК для аналізу замало, то з допомогою ПЛР їхню кількість можна збільшувати в мільйони разів. І вже після цього можна аналізувати цю ДНК за допомогою будь-якого методу.

ПЛР використовує принцип комплементарності ДНК. Цю реакцію здійснює фермент полімераза, який в клітині здійснює процес реплікації. Він прикріплюється до позначеного місця на нитці ДНК і синтезує копію однієї з її ділянок. Для позначення місця, де полімераза починає синтез, використовують спеціальні коротенькі ланцюжки ДНК — праймери, які визначає дослідник.

Після синтезу спочатку підвищують температуру розчину. Висока температура руйнує водневі зв’язки, завдяки чому старий і новий ланцюги ДНК розходяться. Полімераза в цей час не працює. Потім температуру знижують і полімераза знову може працювати. Після цього починається новий цикл синтезу, але тепер уже на двох ланцюгах ДНК (мал. 28.2). Після повторення цього циклу 30-40 разів кількість ДНК стає достатньою для аналізу, навіть якщо спочатку зразок містив лише одну молекулу ДНК. Цю технологію широко використовують у діагностиці різних захворювань і в судовій медицині.

Крім того, за допомогою ПЛР вдається вилучати ДНК з кісток уже вимерлих організмів, що дає змогу читати і їхні геноми. Саме так було прочитано геном неандертальця.

Мал. 28.2. Схема полімеразної ланцюгової реакції

Застосування генетичних маркерів

Метод генетичних маркерів полягає в ідентифікації певних генів, ділянок ДНК, хромосом або окремих особин виду за допомогою притаманних лише їм сполучень нуклеотидів. Генетичні маркери (або ДНК-маркери) — це поліморфні (ті, які мають кілька варіантів) ознаки, які виявляють на рівні нуклеотидної послідовності ДНК під час здійснення досліджень. Таким чином визначають, які з варіантів маркерів є у певних особин популяції, і завдяки цьому можна встановити структуру та історію цієї популяції та порівняти її з іншими популяціями.

Найчастіше для виявлення генетичних маркерів застосовують секвенування ДНК і полімеразну ланцюгову реакцію.

Генетичні маркери можуть розташовуватися в екзонах або інтронах структурних чи регуляторних генів. Вони можуть траплятися і в некодуючих ділянках геному людини, якими є інвертовані повтори, мікросателітні локуси тощо.

Ці маркери широко використовують в популяційних дослідженнях. їх вивчення дозволяє встановити родинні зв’язки різних популяцій людей та їхню історію розвитку (включаючи міграції та схрещування з іншими групами).

ДНК-мікрочіп

Метод ДНК-мікрочіп визначає, які саме з генів у клітині працюють. Крім того, він дозволяє оцінити й рівень активності генів (який із них працює більш, а який менш інтенсивно).

Суть методу ДНК-мікрочіп полягає в тому, що на спеціальній платі розташовується (за допомогою складного роботизованого механізму) велика кількість зондів — невеликих молекул ДНК, з якими взаємодіють молекули РНК, що наявні у досліджуваних клітинах (мал. 28.3). Зондами можуть бути гени як усього геному (на одній скляній платі їх можна розмістити до 40 тисяч), так і певної його частини, яка задіяна у дослідженні. Місце кожного із зондів на платі чітко визначено, що є дуже важливим для здійснення аналізу взаємодії молекул РНК із зондами, бо такий аналіз здійснюється автоматично за допомогою спеціального пристрою.

Мал. 28.3. Розміщення ДНК-зондів на скельці

Мал. 28.4. Взаємодія зонду і молекули РНК на мікрочипі

Мал. 28.5. Результат методу ДНК-мікрочіпу — виявлено комплекси РНК і ДНК-зондів

Усі РНК досліджуваних клітин мітять спеціальними сигнальними молекулами, які забезпечують їхнє забарвлення. Якщо досліджувані клітини зруйнувати і вилити отриманий розчин на поверхню плати, то всі РНК будуть взаємодіяти із зондами, що їм відповідають (мал. 28.4). Після промивки плати, коли всі зайві молекули будуть видалені, лазерний детектор легко знайде сигнальні молекули, що прикріплені до молекул РНК, які зчепилися із зондами відповідних генів, і можна буде визначити, які гени в клітинах працювали (мал. 28.5).

Така технологія дозволяє, наприклад, встановити, які гени в раковій клітині працюють, а які ні, порівняно зі здоровою, або які саме гени «вимикаються» (перестають працювати) або змінюють свою активність у разі певного спадкового захворювання.

Отже, тепер ви знаєте

1. Які молекулярно-генетичні методи використовують під час вивчення спадковості людини? 2. Що таке секвенування ДНК? 3. Як здійснюють полімеразну ланцюгову реакцію? 4. Навіщо потрібні генетичні маркери? 5*. Складіть список обов’язкових компонентів розчину, в якому можна здійснити полімеразну ланцюгову реакцію.

Запитання та завдання

6. На конкретних прикладах поясніть, як методи молекулярної генетики можна використати в судовій медицині. 7*. Запропонуйте спосіб використання методу ДНК-мікрочіп для порівняння активності роботи одного гена в двох різних тканинах.

ДНК-маркер

ДНК-маркер або молекулярно-генетичні маркери, маркер генетичний — поліморфна ознака, що виявляються методами молекулярної біології на рівні нуклеотидної послідовності ДНК, для певного гену або для будь-якої іншої ділянки хромосоми при порівнянні різних генотипів, особин, порід, сортів, ліній.

Мал.1 електрофорез ПЛР продуктів в агарозному гелі й забарвлених бромистим етидієм, отриманих методом IRAP ампліфікації. Ліва доріжка — ДНК відомої довжини (від 900 до 3000 пар нуклеотидів) Мал 2. Стратегії молекулярних маркерів на основі ПЛР ретротранспозонів. A — Sequence Specific Amplification Polymorphism (SSAP), геномна ДНК після рестрикції із допомогою PstI і MseI лігуєтся з адапторами до даних рестрикційних сайтів з подальшою ПЛР із праймерами з LTR і адаптора; B — Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism (IRAP), ПЛР між інвертованими праймерами (праймером) з LTR ретротранспозона ; C — REtrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism (REMAP), ПЛР між праймером із LTR ретротранспозони праймером із простого мікросателітного повтору (наприклад, 5’-CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G); D — Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms (RBIP), мультилокусна ПЛР з використанням праймерів фланкуючих ретротранспозицію та праймера з LTR ретротранспозони.

Наука накопичила великий масив даних про ефективність використання молекулярно-генетичних маркерів, як на рівні білків, так і ДНК, РНК, для вирішення багатьох завдань генетики, селекції, збереження біорізноманіття, вивчення механізмів еволюції, картування хромосом, а також для насінництва і племінної справи.

Найбільш широко використовувані молекулярно-генетичні маркери умовно можна поділити на такі типи —

• маркери ділянок структурних генів, що кодують амінокислотні послідовності білків ( електрофоретичні варіанти білків),
• маркери некодуючих ділянок структурних генів і
• маркери різних послідовностей ДНК, ставлення яких до структурних генів, як правило, невідомо — розподіл коротких повторів за геномом (RAPD — випадково ампліфікуєма поліморфна ДНК; ISSR — інвертовані повтори; AFLP — поліморфізм у сайтах рестрикції) і мікросателітні локуси (тандемні повтори із довжиною елементарної одиниці в 2-6 нуклеотиди).

Є цілий набір сучасних технологій виявлення поліморфізму на рівні ДНК, серед яких можна виділити наступні:

• аналіз поліморфізму довжин рестрикційнихфрагментів ДНК (RFLP);
• аналіз поліморфізму за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та інші методи на основі ампліфікації ДНК між повторюваними послідовностями в геномній ДНК.

Oops something went wrong:

Яку природу мають генетичні маркери Нуклеотидну

Коротко про молекулярні маркери
За допомогою молекулярних маркерів аналізуються характеристики рослин.
Переваги
Швидкий відбір необхідних характеристик рослин, незалежно від впливу навколишнього середовища.
Недоліки
Немає
Розвиток
Застосування в практичній селекції рослин з 1990-х років.
Застосування в KWS
Технологія молекулярних маркерів (також відома як селекція за допомогою маркерів, MAS) регулярно використовується для всіх культур.

Генетичні маркери – це короткі сегменти ДНК з відомим місцем розташування в геномі, які асоціюються з певною ознакою, що цікавить селекціонерів. Із використанням молекулярних маркерів ці ознаки (гени) можуть бути швидко і легко ідентифіковані на ранній стадії розвитку рослини. В результаті, наприклад, стійкість до грибкових захворювань значно легше визначити у сходів рослини. Молекулярні маркери значно підвищують ефективність селекції рослин.

Без цієї сучасної технології довелося б чекати дорослого стану рослини, щоб побачити бажані характерні ознаки. Наприклад, селекціонери схрещують дві батьківські лінії одна з одною і висаджують отримане насіння. Далі з проростка беруть невеликий зразок листка і аналізують його ДНК. Якщо результат показує, що в зразку присутній необхідний маркер, це означає, що у потомства наявна необхідна ознака. За допомогою молекулярних маркерів можна протягом 48 годин визначити наявність ознаки в сорті рослини, що вирощується. Це дозволяє здійснювати попередній відбір потомства і визначати найбільш перспективні рослини.

Відібрані рослини далі перевіряються в польових умовах, що робить процес селекції ще більш ефективним.

Прискорення процесу завдяки геномній селекції

Геномна селекція є продовженням традиційної маркерної технології (MAS) і дозволяє проводити ще кращий і надійніший відбір під час вибору оптимальних партнерів для схрещування під час створення майбутніх сортів. Оскільки вартість аналізу із генетичними маркерами значно знизилася, одна рослина може бути проаналізована на наявність різних маркерів одночасно.

Для цього селекціонери створюють маркерний профіль з кількома тисячами маркерів для кожної окремої рослини. Кожна рослина має специфічний маркерний профіль, який можна порівняти з відбитком пальця. За допомогою вже впроваджених в KWS високоефективних маркерних технологій, маркерні профілі можуть створюватися швидко і економічно.

Тисячі маркерних профілів з однієї популяції рослин потім зіставляються з отриманими польовими даними. На основі цього розробляються статистичні та математичні моделі, які можуть бути використані для прогнозування селекційної цінності рослин і їх придатності для подальшого виведення сортів, що базуються на маркерних профілях насіння або молодих рослин. Потім спеціальна комп’ютерна програма на підставі маркерних профілів інших окремих рослин, які не перевірялися в польових умовах, визначає ті рослини, які найбільш перспективні для схрещувань. Завдяки цьому процесу попереднього відбору не потрібно так багато польових тестувань, тоді як селекційний процес триває.

Застосування геномної селекції у селекційних дослідженнях сприяє підвищенню ефективності селекції і її прогресу.

Огляд наших методів селекції

Схрещування та відбір

Батьківські рослини, що володіють необхідними характеристиками, схрещуються одна з одною. Потім насіння найбільших і продуктивних рослин висівається знову.

Лінійна селекція

У цьому методі схрещуються дві батьківські лінії, чиї бажані характеристики максимально доповнюють одна одну. Найкращі рослини відбираються і знову схрещуються.

Гібридна селекція

За гібридної селекції схрещуються дві генетично різні батьківські лінії.

Культура клітин і тканин

Повноцінні клітини регенеруються з окремих клітин рослини за допомогою поживного середовища в лабораторії.

Молекулярні маркери

Молекулярні маркери використовуються для аналізу характеристик рослин.

Фенотипування

Цей метод передбачає дослідження властивостей батьківських, лінійних або гібридних форм рослин в польових умовах з використанням сучасних технологій автоматизованого аналізу.

Генна інженерія

В цьому методі окремі гени або сегменти генів на ДНК навмисно вводяться в геном культури.

Дослідження генома

В даному випадку досліджується цілісна структура і біологічна функція генома рослини.

Редагування генома

Термін «редагування генома» є спільним для цілого ряду методик, що передбачають точну і цілеспрямовану зміну окремих компонентів ДНК.